叮咚!您有一份10x Genomics單細胞測序上樣建議請查收~

來源: 安諾基因   2019-10-31   訪問量:396評論(0)

時下最火的測序技術當屬單細胞測序,其中10x Genomics平臺無論從通量、成本、穩定性各方面來說都占據著很大的優勢。10x Genomics平臺基于微流控原理進行單細胞分選,對于上機樣本從質量及總量上,都有一定的要求,能否盡可能貼合上機要求往往就是實驗成敗的關鍵今天小編就為大家整理了10x 單細胞測序各種測序策略上樣建議大全,干貨滿滿哦!


10x Genomics 單細胞轉錄組

 

主要樣本類型

新鮮細胞懸浮液

 

細胞重懸Buffer要求

必須不含鈣鎂離子和EDTA,可使用DPBS或其它合適的緩沖液/培養基。

 

細胞數量要求

1. 細胞總量:>10倍目標捕獲細胞數。

2. 細胞濃度:須調整在700-1,200個細胞/μL濃度范圍內,以便樣品直接用于質檢和上機。

 

細胞質量要求

1. 樣本中活細胞百分比率大于90%。

經染色法細胞計數檢測結果判斷,人工計數使用臺盼蘭染料,細胞計數儀計數可使用AO/PI熒光染料活臺盼蘭染料。

2. 無大于40 μm的細胞碎片、組織碎片、纖維灰塵等各類雜質,總雜質含量經估算應<5%。

可使用40 μm細胞濾網進行過濾除雜,雜質較多且細胞數充足前提下可進行多次過濾。

3. 細胞呈單分散狀態,細胞結團率<5%

Buffer/培養基中添加BSA/血清可提供一定的抗結團作用,必要時應使用寬口吸頭進行輕緩吹打使細胞分散。

4. 細胞懸浮液中不含逆轉錄抑制劑成分,不含游離核酸。

將細胞由含鈣鎂離子或EDTA的Buffer/培養基轉入不含鈣鎂離子或EDTA的Buffer/培養基中時,應對細胞進行清洗和離心收集至少兩次,以保證干凈去除這些反應抑制劑和游離核酸;操作過程中應盡量保證細胞活性和縮短操作時間,避免細胞邊處理邊死亡造成游離核酸不斷釋放。


 

10x Genomics ATAC


主要樣本類型

新鮮細胞核懸浮液

 

細胞核重懸Buffer要求

必須重懸于當天新鮮配制的Nuclei Buffer(官方提供)中。

 

細胞核數量要求

1. 細胞核總量:>35,000個細胞核。

2. 細胞核濃度:3,080-7,700個細胞核/μL。

 

細胞核質量要求

1. 樣本中活細胞百分比率大于90%。

經染色法細胞計數檢測結果判斷,人工計數使用臺盼蘭染料,細胞計數儀計數可使用AO/PI熒光染料活臺盼蘭染料。

2. 無大于40 μm的細胞碎片、組織碎片、纖維灰塵等各類雜質,總雜質含量經估算應<5%。

3. 細胞核呈單分散狀態,結團率<5%。

4. 細胞核懸浮液中不含轉座反應抑制劑成分,不含游離核酸

對細胞核進行清洗時應注意離心條件的優化,避免造成細胞核數量損失;操作過程中應盡量輕緩和縮短操作時間,避免造成游離核酸不斷釋放。

5. 使用高倍物鏡(40x 或60x)對所得細胞核進行觀察質檢,細胞核膜應無破裂,光滑圓潤


10x Genomics Feature Barcode蛋白組&轉錄組

 

主要樣本類型

新鮮細胞懸浮液

 

細胞重懸Buffer要求

必須不含鈣鎂離子和EDTA,可使用DPBS或其它合適的緩沖液/培養基。


細胞數量要求

1. 細胞總量:至少1.5x106個細胞。

注意一般1x106個細胞對應抗體-核酸使用量為1 μg,另0.5x106細胞用于細胞計數和活性檢測。

2. 細胞濃度:需根據具體選用抗體-核酸的效價/用量,調節為適宜濃度。

 

細胞質量要求

可參考上文10x Genomics 單細胞轉錄組細胞質量要求。

 


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